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上海基诺:PCR技術盤點

概要

上海基诺开奖记录 www.mqxypk.tw PCR技術的基本原理類似于DNA的天然復制過程,由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成:模板DNA的變性,模板DNA與引物的退火(復性),引物的延伸。

PCR技術的基本原理類似于DNA的天然復制過程,由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成:模板DNA的變性,模板DNA與引物的退火(復性),引物的延伸。重復循環變性--退火--延伸三過程,就可獲得更多的“半保留復制鏈”,而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2~4分鐘,2~3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。反向PCR(inverse-PCR)反向PCR(inverse-PCR)是克隆插入片段側翼序列非常有效的方法。通常采用的Tail-PCR假陽性太多,而Inverse-PCR一般只要有特異條帶,基本上就是目的片段。

直接原位PCR

原位PCR是原位雜交細胞定位和PCR的高靈敏度相結合的技術,使得靶基因檢測有了極大的改進。此技術是在細胞(爬片、甩片或涂片)或組織(石蠟、冰凍切片)上直接對靶基因片段進行擴增,通過摻入標記基團直接顯色或結合原位雜交進行檢測的方法。

間接原位PCR(原位雜交PCR)

與直接原位PCR所不同的是,靶基因在擴增時不進行標記基團的摻入,而是標記一段與擴增片段互補的探針,在擴增結束后,應用此探針進行原位雜交。因此,此處主要介紹原位雜交,其余方法同原位PCR。

逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)

逆轉錄-聚合酶鏈反應(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)的原理是:提取組織或細胞中的總RNA,以其中的mRNA作為模板,采用Oligo(dT)或隨機引物利用逆轉錄酶反轉錄成cDNA。再以cDNA為模板進行PCR擴增,而獲得目的基因或檢測基因表達。

實時熒光定量PCR(realtime PCR)

所謂實時熒光定量PCR技術,是指在PCR反應體系中加入熒光基團,利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程,最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。重疊延伸PCR重疊延伸PCR技術(gene splicing by overlap extension PCR,簡稱SOEPCR)由于采用具有互補末端的引物,使PCR產物形成了重疊鏈,從而在隨后的擴增反應中通過重疊鏈的延伸,將不同來源的擴增片段重疊拼接起來。

甲基化PCR甲基化特異性聚合酶鏈反應(MSPCR)

其作用原理基于DNA經亞硫酸氫鈉處理后,來自父方非甲基化序列的胞嘧啶轉變為尿嘧啶,而來自母方甲基化序列則保持不變,隨后用具有高度特異性的引物進行擴增。

降落PCR

降落PCR(touchdown PCR),一種PCR技術,主要用于PCR的條件的優化。在許多情況下引物的設計使得PCR難以進行,例如特異性不夠易錯配等。退火溫度過高會使PCR效率過低,但退火溫度過低則會使非特異擴增過多。差示反轉錄PCR實驗差示反轉錄PCR也稱為mRNA差異顯示技術,它是將mRNA反轉錄技術與PCR技術二者相互結合發展起來的一種RNA指紋圖譜技術,簡便、靈敏、RNA用量少、效率高、可同時檢測兩種或兩種以上經不同處理或處于不同發育階段的樣品,該方法自問世以來被廣泛用于差異表達基因的克隆鑒定研究中。

第三代PCR技術

第一代PCR就是常見的定性PCR技術,它采用普通PCR儀來對靶基因進行擴增,采用瓊脂糖凝膠電泳來對產物進行分析。第二代PCR就是熒光定量PCR技術(Real-Time PCR,qPCR),它通過在反應體系中加入能指示反應進程的熒光試劑來實時監測擴增產物的積累,借助熒光曲線的Cq值來定量起始靶基因的濃度。

第三代PCR技術--數字PCR(Digital PCR,dPCR,Dig-PCR),是一種全新的對核酸進行檢測和定量的方法。它采用直接計數目標分子而不再依賴任何校準物或外標,即可確定低至單拷貝的待檢靶分子的絕對數目。

PCR芯片技術PCR儀器發展的趨勢之一變得更加微型化,PCR芯片就是在這種趨勢下誕生的。PCR芯片就是在微型的載體上進行PCR反應,是微型化的PCR儀。芯片PCR不僅節省了大量反應試劑因此降低了實驗成本,還有助于提高反應速度。