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上海基诺彩票:什么?CRISPR可以做分子診斷了?且看系列報道之Cas12a

概要

上海基诺开奖记录 www.mqxypk.tw 免疫是人類健康的第一道防線,是防衛病原體入侵最有效的武器。今天談談細菌或古生菌的免疫。細菌免疫系統CRISPR-Cas的發現引發了技術革命浪潮并產生了極大的社會影響。

導讀

免疫是人類健康的第一道防線,是防衛病原體入侵最有效的武器。今天談談細菌或古生菌的免疫。細菌免疫系統CRISPR-Cas的發現引發了技術革命浪潮并產生了極大的社會影響。

新發現的Cas12/Cas13/Cas14不同于Cas9,使得CRISPR系統在病原體的快速診斷和腫瘤基因檢測領域的應用成為可能,本期我們重點關注“新魔剪”Cas12a,看看它如何瘋狂切割單鏈DNA,實現對腫瘤基因或特定病原體的檢測。

CRISPR-Cas系統背景回放


面對噬菌體的威脅,細菌進化出了一套專門針對噬菌體或外源性遺傳物質的CRISPR-Cas免疫系統。CRISPR全稱為“簇狀、規律間隔的、短回文重復序列”(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats),是由眾多短而保守的重復序列區(repeat)和間隔區(spacer)組成。如圖1所示: Repeat是細菌固有序列,能夠同時結合Cas蛋白和spacer的序列,而spacer則是細菌(或是其祖先)感染過的病毒序列。一旦噬菌體感染發生,絕大多數的細菌死亡,極少部分的細菌由于其基因變異得以生存。這些細菌中的一部分,將噬菌體的DNA序列切割后,插入repeat區域中,形成spacer,從而獲得類似高等生物“免疫記憶”的能力。

圖解CRISPR-Cas系統獲得性免疫的機制

(Van Der Oost J, Westra  ER,et al. 2014)


隨著CRISPR-Cas機理的逐步揭示和新的Cas酶(Cas12/Cas13/Cas14)的發現,科學家們發現這個系統非常強大,可以精準高效地實現基因編輯,比如對某個基因的敲除、插入和替換等。而CRISPR系統的序列特異性識別能力已經被應用在越來越多的領域,如醫藥,食品,農業和工業生物技術等,這些應用很大程度上都是以Cas9為基礎進行開發的,而新發現的Cas12/Cas13/Cas14不同于Cas9,使得CRISPR系統在病原體的快速診斷和腫瘤基因檢測領域的應用成為可能。


Cas12a-單鏈DNA的“新魔剪”



今年4月,有CRISPR女神之稱的Jennifer Doudna 教授在《Science》撰文指出Cas12酶家族在gRNA的引導下與目標序列結合以后,便會切換為激活狀態,瘋狂的切割體系內其它的單鏈DNA。Cas12a這一特點可被用于分子診斷領域,實現對腫瘤基因或特定病原體的檢測。在體系內加入含有報告基團的單鏈底物后,如果Cas12a識別到靶序列(目標病原體或腫瘤基因)的存在,就會切割單鏈底物從而釋放熒光報告基團。


Cas12a具有靶向切割單鏈DNA活性及附帶切割特點

(Chen JS,  Ma E,  et al. 2018)

Cas12a可以實現HPV的準確分型




但是如果樣本中的目標基因含量非常少,Cas12a與gRNA復合物匹配到需檢測靶序列的概率很低。此時就需要先擴增靶序列,提高需要檢測底物的豐度。PCR(聚合酶鏈式反應)是常用于這一目的擴增手段,但是需要專門的PCR儀進行溫控反應。而另外一種信號擴增技術——重組聚合酶擴增(RPA),可以在恒溫狀態下實現信號的擴增,而不需要復雜的升溫降溫過程。Doudna教授創新性的將Cas12a靶向切割單鏈DNA的特性與RPA技術聯合起來,開發了一種名為DETECTR的技術(DNA Endonuclease-Targeted Crispr Trans Reporter)。研究結果表明,肛拭子取樣后等溫擴增10分鐘,使用Cas12a系統對擴增產物進行檢測,可以在1小時內檢測到人乳頭瘤病毒(HPV)并準確區分兩種相似的亞型,HPV16和HPV18。DETECTR技術的開發為實現病原體或腫瘤基因的即時檢驗(POCT) 又提供了一個強有力的支撐平臺。


研究者基于CRISPR-Cas12a聯合 RPA技術開發的

DETECTR技術(Chen JS,  Ma E,  et al. 2018)




      那CRISPR-Cas12a與CRISPR-Cas9有什么區別呢? Cas9是最早發現的Cas酶之一,也是目前為止研究最深入和應用最廣泛的Cas酶,在基因編輯、疾病治療等方面的應用前景巨大。然而CRISPR-Cas9缺乏切割單鏈核酸的酶活結構域,無法用于體外檢測。而Cas12/13/14則普遍存在第二個酶活結構域,當蛋白正確結合到靶向序列時,能夠激活這一結構域,切割探針小分子,實現從待檢序列信息到熒光信號的轉化?;謁塹惱庖惶氐?,在醫學檢測領域需要靶向檢測已知序列的情況下,能夠實現普通實時定量PCR所無法達到的靈敏度,擺脫對實時定量PCR儀的依賴。