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上海基诺:利用二代測序技術在不明原因發熱的血液樣本中檢測到人細環病毒

概要

上海基诺开奖记录 www.mqxypk.tw 為便于研究長期發熱癥狀,Petersdorf[1]在1961年通過對100例患者前瞻性觀察,首次提出不明原因發熱(fever of unknownorigin,FUO)的概念。

為便于研究長期發熱癥狀,Petersdorf[1]在1961年通過對100例患者前瞻性觀察,首次提出不明原因發熱(fever of unknownorigin,FUO)的概念。隨著診斷技術的不斷發展,不明原因發熱的概念也在不斷擴展,目前感染性疾病是FUO的最主要原因[2],在20世紀90年代,20%~60%的FUO病屬于感染性疾病[3]。而進入21世紀后的10年內,最主要的感染病原為細菌、病毒以及真菌和寄生蟲。近年來病毒感染比例呈明顯上升趨勢。然而傳統的分子生物學檢測方法需要病原基因組序列的先驗知識,因此對于樣本中的未知病原需要有新的序列非依賴性的檢測手段來處理。


近些年來,隨著二代測序技術(NGS)的飛速發展,得益于二代測序通量的高速提升和成本的大幅下降,使得二代測序技術越來越廣泛的應用于宏基因組檢測未知病原的研究領域中。相對于傳統的序列依賴性的核酸檢測技術,如PCR技術等,二代測序結合宏基因組技術具有不依賴于病原序列信息的特性,因此對臨床樣本的檢測使得我們能夠得到更加廣泛的病毒譜,進而也可以發現一些用傳統方法無法觀察到的病原組成情況[4]。


本研究中,對10份不明原因發熱癥狀的血液樣本進行宏基因組測序(metagenomics shotgun sequencing, MSS)時,發現了大量的人細環病毒(torque teno Virus,TTV)相關序列。對這些序列進行組裝拼接并分析其進化樹后,發現其分屬于α TTV、β TTV和γ TTV三個屬。


材料與方法


1.1 實驗材料與方法

選取10份漢坦病毒IgG抗體檢測(ELISA)陰性的不明原因發熱的臨床血液樣本(均為出現發熱癥狀后一至兩周內采集),采用Qiagen公司的RNease Mini Plus Kit試劑盒進行核酸提取。病毒基因組的反轉錄采用Invitrogen公司的Superscript Ⅲ試劑盒進行一鏈合成,隨后加入Klenow片段37 ℃孵育2 h進行二鏈合成。反轉后的cDNA采用REPLI-g WTA Single Cell Kit(Qiagen)試劑盒進行基于多重鏈置換反應(multiple displacement amplification,MDA)的預富集。采用Thermalfisher公司的Ion Torrent Hi-Q試劑盒構建測序文庫。以上步驟均按照相關廠商提供的標準流程進行。測序反應在Ion Torrent PGM(Thermalfisher)平臺上完成。


1.2 數據分析

所有原始數據均為從Ion Torrent平臺下載的bam格式下機數據,應用本地分析軟件Virus IdentificationPipeline(VIP)進行分析[5]。


結果


2.1 測序結果

在10份樣本中均發現了不同程度的TTV感染,其中2號和6號樣本為單一性的α TTV感染;1號、5號和9號樣本為α TTV和γ TTV共感染;7號樣本為α TTV和β TTV共感染;3號、4號、8號和10號樣本為α TTV、β TTV和γ TTV共感染。α TTV、β TTV和γ TTV的感染率分別為100%、50%和70%(表1)。在這10份樣本中,α TTV、β TTV和γ TTV3種TTV基因組覆蓋度達到70%以上的概率分別為:60%、30%和40%(表1)。其中8號樣本病毒載量最高,α TTV、β TTV和γ TTV3種TTV基因組覆蓋度均達到99%以上,αTTV和γTTV的平均測序深度達到了400×以上(表1)。所有匹配讀長(Reads hit)在整個病毒基因組上的位置如圖1所示。

圖1 8號樣本中三種TTV(A:TTV, B:TTMV, C:TTMDV)一致性序列的進化分析(紅色圓點代表組裝出的一致性序列,藍色方塊代表親緣關系最近的代表株)

Fig.1 Phylogenetic analysis of TTV in 3 genera (A: TTV, B:TTMV, C:TTMDV) in sample 8 (red dotrepresent the assembled consensus sequence, blue square represent the closestreference)


表1 α TTV、β TTV和γ TTV在10份血液樣本中的測序數據

Tab.1 Sequencing data ofα TTV, β TTV and γ TTV in 10 serum sample


2.2 進化分析

用10份樣本中的測序reads組裝出的置信序列與從GenBank引用的TTV各型別的代表株以NJ法構建序列進化發生樹。其中8號樣本的三種TTV序列進化樹分別見圖1。


討論


不明原因發熱(FUO)是常見的臨床綜合征,病因廣泛,有報道超過200種疾病能夠引起FUO。據統計,在1952-1994年間的FUO病例中,感染性疾病(占比28%)為主要病因,非感染性炎癥占比21%,惡性腫瘤占比17%,病因不明占比19%[2]。在非細菌感染樣本中,病毒感染呈明顯上升趨勢。但在無先驗經驗的情況下,傳統免疫學方法和分子生物學手段難以對樣本中的未知病毒病原進行鑒定。隨著高通量測序技術的發展,越來越多的新的病毒病原被發現。而這些新發現的病毒飛速的革新著我們關于病毒復雜程度的認知。越來越多的證據表明,這些新發現的病毒比傳統已知的病毒病原在臨床樣本中分布更為普遍。傳統意義上的病毒組(virome)的概念現在看來僅僅是構成人體宿主宏微生物組的一部分[6]。盡管腸道微生物組的研究是當今的熱門,但是血液病毒組對于宿主免疫反應和器官移植的安全依然有著極其重要的指示功能[7][8]。


近些年來,關于環狀、復制起始蛋白編碼的單鏈DNA病毒[circular,replication initiatorprotein(Rep)encoding,single-strand DNA virus,CRESS-DNA virus]的報道越來越多。這些病毒曾經被認為只能感染植物或動物,但近10年的研究發現,該類病毒具有十分寬廣的宿主范圍,包括人在內的脊椎動物到無脊椎動物均包含在內[9]。這類病毒包括:Anellovirus;Circovirus;Cyclovirus;Gemycircularvirus;Gyrovirus;Smacovirus等[10,11,12,13]。這些病毒的病原學特性依然不清楚。而有報道稱Anellovirus能占到整個病毒組的70%左右[14]。在本研究中,核酸提取雖然采用的是RNA提取試劑盒,但也能夠采集到足量的病毒DNA,滿足檢測的需求。在本研究及類似的研究中[15],作為DNA病毒的TTV的核酸均由RNA提取試劑盒所提取。


人細環病毒(torque teno virus,TTV)最早于1997年在日本一例輸血后發生急性感染的非甲-戊型肝炎患者血清中發現[16],被懷疑與肝炎相關。隨后TTMV(Torque teno mini virus,)與TTMDV(Torque teno midi virus)分別于2000年和2007年[17]相繼被發現。隨后的研究表明,人TTV在世界范圍內存在廣泛的分布[18,19]。國際病毒分類委員會(International Committee on Taxonomy of Viruses,ICTV)將TTV歸類于一個新建立的科:指環病毒科(Anelloviridae),目前該病毒科共包含9個病毒屬:α TTV(Alpha torquevirus)、β TTV(Betatorquevirus)、γ TTV(Gamma torquevirus)、δ TTV(Delta torquevirus)、ε TTV(Epsilontorquevirus)、η TTV(Eta torquevirus)、ι TTV(Iota torquevirus)、θ TTV(Thetatorquevirus)、ζ TTV(Zeta torquevirus)。目前國際病毒分類委員會主要以ORF1基因為基礎對TTV進行分類。以堿基序列35%的一致性為閾值來劃分以人為宿主的3個屬:Alphatorquevirus genus(Torque teno virus,TTV),Betatorquevirus genus(Torque tenomini virus,TTMV)和Gammatorquevirus genus(Torqueteno midi virus,TTMDV)[15]。除此之外還有其他以各種動物為宿主的屬:豬細環病毒(Torque teno sus virus, TTsuV),貓細環病毒(Torqueteno felis virus),狗細環病毒(Torque teno canis virus)以及樹鼬細環病毒(Torque teno tupaia virus)[20],近些年來,在嚙齒類以及蝙蝠中也發現了相關的TTV。到目前為止,TTV被認為分為5個主要的進化簇,包含數10株準種。各準種間在ORF1上的堿基序列的差異超過35%[21]。在本研究中,二代測序產生的讀長在α TTV、β TTV和γ TTV3個屬中均有分布。其中α TTV感染率最高,在10份樣本中均有檢出,γ TTV和β TTV排在其后,分別在7份和5份樣本中檢出。全部樣本中未發現其他屬TTV相關的測序讀長。而全部的10份樣本中,除1號樣本外,其余9份樣本的α TTV檢出水平高于β TTV和γTTV。在β TTV和γ TTV之間,除了2號和6號樣本兩者均未檢出,7號樣本β TTV檢出高于γ TTV以外,其余7份樣本中γ TTV檢出均高于β TTV。


TTV基因組為單股負鏈環狀DNA,無包膜?;蜃櫬笮〈?.86 ~2.91 kb(TTMV)、3.24~2.35 kb(TTMDV)到3.6~3.9kb(TTV)不等,包含4個開放閱讀框(openreading frame,ORF),約2.6 kb,以及一個非編碼區(untranslated region, UTR),約1.2 kb。不同TTV分離株之間編碼蛋白的氨基酸差異可以高達47%~70%[19,22]。這種差異性分布并不均一,在編碼區明顯多于非編碼區。


對于TTV基因組如此高變的解釋是TTV擁有非??斕耐槐淥俾?sup style="word-wrap:break-word;">[22],但有趣的是,作為一個DNA病毒、在缺乏自我復制機制、必須利用宿主具有高校準能力的DNA聚合酶系的情況下,依然擁有如此高的突變速率。合理的解釋是由于其單鏈的基因組結構和編碼復制過程中涉及的蛋白的能力所致[23]。另一種解釋是僅有小部分TTV擁有完整的感染宿主細胞的原件,而大多數情況下感染宿主細胞是1個多準種的協同過程。也有報告稱Epstein-Barr virus(EBV)在TTV的感染過程中起到了協助的作用[24]。


TTV在世界范圍內廣泛存在,但分布并不均一,報道過的在人群中的分布最低到5%[18],最高達到90%[25]。與第一次被發現相似,TTV普遍存在于各類血液疾病、器官移植、腫瘤甚至牙周炎患者的體內。在健康人群中同樣存在廣泛的分布[25],并且這種分布隨年齡的增加而提高[26]。


TTV具有作為免疫標志物的巨大潛力,其廣泛的分布意味著TTV已經建立起與宿主之間成功的互作關系。在一些采用PCR方法對TTV的病毒血癥進行長期監控的研究中[27],即便TTV陰性患者在免疫抑制狀態下也會變為陽性。提示病毒在組織中比在外周血中有更高的免疫耐受。Kincaid等[28]的研究發現,一種由TTV編碼的miRNA所介導的免疫逃逸機制,加上TTV在正常人群中的廣泛而均一的分布,使得TTV成為了一種免疫低下或免疫缺陷的標記。這種miRNA靶向作用于N-myc (and STAT)的反應原件(N-myc interactor,NMI),由此產生對干擾素的干擾作用,并促使細胞增殖裂解。


由于缺乏合適的細胞系,TTV難于進行體外培養。同時缺乏相關的血清學方法來驗證病毒代謝產物與特異性的抗病毒免疫反應。而TTV本身基因組高度的變異以及與宿主相互作用的復雜性,都使得TTV潛在的病原特性難以評估。因此,迄今為止尚未有明確的研究證據證明人細環病毒與任何臨床癥狀具有直接的關系。在本研究中,未檢測到明確致病病原可能由以下原因導至:一是在越來越多的報道中所高度懷疑的TTV潛在的病原特性[15];二是由于10份血液樣本均為出現發熱癥狀7~14d內所采集,而真正的致病病原的基因組序列信息有可能因為宿主已處于非急性期而含量偏低,導至在宿主血液中已經難以檢測到,推測宿主免疫系統對發熱致病病原產生應急反應和免疫應答后,宿主免疫水平進入相對的受抑制或低下狀態。而在采樣時,宿主可能依然處于免疫受抑制或免疫水平低下狀態,從而導至TTV在血液中的檢出率升高。雖然TTV的病原學特性并不明確,這種現象提示TTV、宿主與致病病原三者間存在一定的相關性。另外,考慮到患者并未發現惡性腫瘤或非感染性炎癥等癥狀,那么其他不明病因導至的發熱,以及由此而來的宿主免疫水平的下降,則可能導至潛伏的TTV在血液中的檢出率升高。


選自中華實驗和臨床病毒學雜志, 2018,32(2)